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    肿瘤双抗药物的挑战与开发策略

    2021-12-02 10:29
    小药说药
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    概述  

    迄今为止,与传统的抗癌治疗策略相比,免疫治疗被认为是最有前景的全身性肿瘤治疗方法,在提高治疗效果方面发挥着不可或缺的作用,尤其是对难治性癌症的治疗。新兴的癌症免疫疗法包括癌症疫苗、嵌合抗原受体的T细胞(CAR-T)治疗、细胞因子治疗、免疫检查点抑制剂和肿瘤靶向单克隆抗体(mAbs)。其中,单克隆抗体因其特异性靶向分子的能力,已成为癌症治疗中一种关键和有效的治疗方式。然而,由于肿瘤复杂的疾病发病机制,针对单一靶点的单克隆抗体往往不足以表现出足够的治疗效果。因此,针对多个靶点的双特异性抗体(bsAbs)应运而生,它的发展改变了肿瘤免疫治疗的领域。

    由于能够同时针对肿瘤细胞或肿瘤微环境(TME)中的两个表位,bsAbs逐渐被成为下一代治疗性抗体的一个重要和富有前景的组成部分。目前正在开发的大多数bsAbs被设计成通过将免疫细胞,特别是细胞毒性T细胞,与肿瘤细胞紧密相连,从而形成一个人工免疫接触,最终导致靶向肿瘤细胞的选择性攻击和裂解。虽然存在多种bsAb形式,但根据FC片段的存在与否,可将其大致分为两类:IgG样和非IgG样。Fc片段的存在显著地发挥了额外的效应器功能。目前,许多临床前和临床试验正在进行中。然而, bsAb药物在肿瘤治疗中的应用仍然面临着巨大的挑战,包括肿瘤异质性和突变负荷、难以控制的肿瘤微环境、激活T细胞的共刺激信号不足、持续注射的必要性、致命的全身副作用和脱靶的毒性作用。针对这些问题,本文提出了多种策略来解决这些问题,包括制备多特异性bsAb、发现新抗原、将bsAb与其他抗癌药物结合、开发基于NK细胞的bsAb和原位制备bsAb。

    bsAb的设计策略

    bsAb通过同时结合不同的抗原或表位而表现出双重特异性,它们在肿瘤治疗领域受到了广泛的关注,主要有四种作用:(a)重新定向特异性免疫效应细胞,选择性地破坏癌细胞;(b)靶向多种细胞表面抗原,从而提高靶向特异性;(c)向肿瘤内输送药物;以及(d)通过阻断两种生物学途径来提高治疗效力和持久性。在这些功能中,最常用的一种功能是使免疫效应细胞靠近癌细胞,从而降低全身毒性,规避耐药性,bsAb大致分为两组:(a)IgG样(有Fc区)和(b)非IgG样(无Fc区)。

    具有Fc区的IgG样bsAb由于其较大的尺寸和FcRn介导的再循环过程,比没有Fc区域的bsAb具有更长的循环半衰期。纯化更方便,溶解度和稳定性提高。更重要的是,它可能具有更大的临床治疗潜力,以保留多种Fc介导的效应器功能,包括抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)和Ab依赖性细胞吞噬作用。

    非IgG样bsAb片段相比之下,显示出相对较低的循环动力学,但具有更好的组织穿透能力,较低的免疫原性,以及较低的固有免疫系统的非特异性激活。这种形式的bsAb主要依赖于其抗原结合能力发挥多种功能。

    为了延长非IgG样结构的半衰期,同时保持其原有的生物活性、安全性和低免疫原性,可采用多种策略来增加其分子量并延长其在血清中的半衰期:(a)用肽接头使Ab片段形成多聚体;(b)与其他分子如人血清白蛋白、聚乙二醇(PEG)、碳水化合物、N-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)和葡聚糖偶联。Ab片段的多聚化,以多聚单链抗体为例,是非IgG类似形式的核心策略。

    bsAb技术平台的发展历史  

    bsAb的历史可以追溯到1961年,当时Nisonoff和Rivers首次提出通过混合不同的Ab片段来产生多特异性Abs的概念。在杂交瘤技术和化学重组方法分别于1975年和1985年建立的早期阶段,BSAb的产生依赖于杂交瘤体细胞融合产生四瘤体或两个不同单抗的F(ab′)2分子的化学异共轭。然而,因为化学偶联可能使bsAb失活、展开或聚集,bsAb的进一步发展受到阻碍。同时,四元体技术常常错误地组装重链和轻链,从而导致所需配对的产率降低,并产生意想不到的免疫反应。从本质上讲,正确的重链-轻链配对通常包括两个方面:(a)两个不同的重链的正确配对;(b)轻链与相应的正确重链相结合。这些问题迫切需要改进方法来产生正确配对的bsAb。最初,重链/轻链的错配问题是在1995年通过创造一个嵌合的鼠/鼠源四联体来解决的,这保证了同源重链的正确配对。例如,临床批准的catumaxomab由小鼠IgG2a抗CD3半抗原与大鼠IgG2b抗上皮细胞粘附分子(EpCAM)半抗原组成。1998年,相同的轻链配对两个重链的应用也显示出了效果。然而,重链错配和免疫原性仍然存在,临床应用范围有限,需要更好的解决方案。

    迅速发展的基因工程技术为克服上述缺点提供了机会,这促进了第二波bsAb的开发。这些新开发的bsAb的生产主要依靠重组DNA技术,在控制bsAb的大小、亲和力、双特异性、半衰期、稳定性、溶解度和生物分布等属性的同时,能够产生嵌合或人源化的抗体,以满足所需目标产品的不同需求。1996年,Ridgway等人描述了利用CH3结构域突变产生人源化抗CD3×CD4杂交的“knobs into holes”(KiH)方法。这种方法是通过在bsAb的一个重链中用一个小的氨基酸替换大的氨基酸(hole),在bsAb的另一个重链(knob)中反之,最终根据静电导向理论引导形成异源二聚体而不是同源二聚体。利用噬菌体展示技术筛选出形成稳定异二聚体的CH3突变体。此外,为了减少单体或同源二聚体杂质,一些研究人员进一步设计重链的CH3结构域,以添加链间二硫键,进一步提高异二聚体并提供纯化的可能性。该技术还可通过将肽、蛋白质配体或Ab片段融合到Fc链的两端来产生各种类型的异二聚体蛋白质。之后,称为CrossMab的新技术的出现进一步减少了重链/轻链配对的副产物。这是通过在一个Abs的Fab区内交换重链和轻链结构域来实现的,从而导致VH-VL和CH1-CL之间界面的分子结构发生变化,以完整的Fc和抗原结合域构建了抗血管生成素-2和血管内皮生长因子a的CrossMab-bsAb,其稳定性和亲和力均高于其亲本抗体。CrossMab形式可进一步分为三个亚型,CH1配CL(CrossMabCH1-CL),VH配VL(CrossMabVH-VL),或VL-CL配VH-CH1(CrossMabFab)。CrossMab不需要序列优化或附加接头,成为设计新型bsAb的一种有吸引力的方法。此外,它可以与KiH结合,以确保重链的正确配对。

    随着基因工程技术的进步,以及噬菌体展示、蛋白质工程、转基因小鼠等多种方法的出现,目前已发展出100多种bsAb形式。这些新开发的形式规避了以前的制造问题,如不稳定、低收率和免疫原性,从而加速了从试验台到临床的速度。如上所述,通用的bsAb格式可以简单地分为两类。一方面,除了quadromas、KiHs和CrossMab外,IgG-like形式还包括双可变域Ig(DVD-Ig)、IgG单链Fv(IgG-scFv)、二合一或双作用Fab抗体(DAF)和κλ-body等形式。

    另一方面,非IgG样形式包括单链抗体、纳米抗体、dock and lock(DNL)方法和其他多价分子。单链抗体是指两个来自亲本Ab轻链和重链可变区结构域的组合,即VH和VL。它们通过一个肽接头连接,通常是(G4S)3序列。基于单链抗体的形式包括scFvs、sdAb、ta-scFv、diabodies、TandAbs和DART。在这种格式中,BiTE是最典型和应用最广泛的一种。美国食品和药物管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)分别于2014年12月和2015年12月批准了抗CD19×CD3的blinatumomab(Blincyto;Amgen),用于治疗费城染色体阴性的复发或难治性前体B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALLs)。迄今为止,各种bsAb形式已在其他多个综述中都有总结。

    bsAb的临床应用

    bsAb的首次临床试验是在1990年进行的。利用化学偶联的抗CD3单抗OKT3和抗胶质瘤单抗NE150治疗恶性胶质瘤。1995年,bsAb首次通过静脉注射抗CD3×CD19的bsAb治疗化疗耐药的非霍奇金淋巴瘤(NHL)。令人失望的是,虽然观察到有限的全身毒性,但该试验没有临床反应,只观察到血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)和CD8+T细胞增加。同年,第一个BiTE,由两个靶向CD3和17-1A的单链抗体连接而成,也就是抗CD19×CD3的blinatumab的前体。1997年,针对FcγRIII(CD16)和霍奇金相关抗原CD30激活NK细胞的bsAb在临床I/II期研究中显示出令人鼓舞的抗肿瘤活性。利用重组DNA技术,blinatumomab避开了以前产量低、副产品不明确和纯化程序复杂的问题。一年后,Blinatumomab在德国和瑞典进入了人类研究的第一个阶段,其中21例复发或难治性NHL患者接受短期静脉注射。直到2004年,NHL患者才首次观察到blinatumomab有意义的临床反应,剂量为每天15?g/m2。几年后,blinatumomab被用于广泛的临床试验,直到最后通过FDA和EMA的批准。在随后的几年里,blinatumomab的治疗范围进一步拓宽,2018年,随着FDA批准其用于首次或第二次完全缓解后MRD≥0.1%的pre-B ALL患者群体的治疗,bsAb领域经历了爆炸式增长,未来临床发展前景广阔。

    抗原变异逃逸的解决方案

    为了同时处理两个靶点,同时保持它们的效力,产生bsAb的第一步是确定合适的靶抗原。与传统的Abs类似,bsab的靶点应满足以下标准:(a)它们在靶细胞而不是邻近的正常细胞中有明显的表达,以避免非特异性毒性(也称为“靶向非肿瘤”毒性);(b)它们与恶性肿瘤表型或防止抗原突变引起的免疫耐受的信号通路密切相关。目前,只有一小部分肿瘤相关抗原(TAA)被识别并严格满足上述标准,这一点令人沮丧。其中CD19最具代表性,CD19在大多数B-ALL上表达,对B细胞的发育和功能是必不可少的,因此是CAR-T细胞或基于bsAb的免疫治疗的重要靶点。然而,有报道称,CD19特异性CAR-T细胞或抗CD19×CD3的BiTE在B-ALL治疗中的失败归因于CD19的基因突变,导致CD19细胞外结构域的丢失,构象变化,向细胞表面的转运受损,或从ALL到急性髓细胞白血病(AML)的表型转化。因此,如果只有一个TAA靶向癌细胞,所选TAA的基因改变可能会对免疫治疗的效果构成威胁,这给我们带来了一个巨大的挑战。

    策略1:发展多特异性抗体;以避免单一靶点相关的免疫无效,一些研究者提出多靶点抗体的想法,以同时识别靶癌细胞表面的多种抗原,提高亲和力。例如,产生促红细胞生成素的肝细胞(Eph)受体家族的三个成员EphA2、EphA4和EphB4参与了许多恶性肿瘤的进展和转移,它们都是很有吸引力的抗肿瘤治疗靶点。在此基础上,通过将抗EphB4/EphA4双抗体连接到完整的抗EphA2抗体的C端,设计了一种三特异性抗体。这一策略的另一个例子是双靶向单链抗体的三特异性抗体同时识别AML癌细胞上的CD123和CD33。与单靶向药物相比,它表现出明显更强的抗肿瘤活性。此外,靶向内皮生长因子受体(EGFR)、HER2、HER3和VEGF的四特异性Abs在体外和体内也显示出比单靶向药物更有效的抗肿瘤效果,并且能够破坏其亲本bsAb诱导的耐药性。

    策略2:新抗原的发现;由于其高突变负荷和对当前肿瘤免疫治疗明显的耐药性倾向,因此识别新抗原并确定相关内在机制为改进抗肿瘤策略铺平道路是一项挑战,但也是紧迫的任务。简而言之,新抗原,也称为肿瘤特异性抗原(TSA)来源于非同步体细胞突变,在肿瘤细胞中特异性表达,而在正常细胞中完全缺失。以前,大多数免疫疗法针对的是TAA,因为它们通常在一组肿瘤类型中过度表达,因此覆盖了更广泛的患者群体,如CD19。然而,基于TAA治疗的累积研究报告了正常组织潜在的损伤,同时临床疗效不理想。相反,TSAs在肿瘤细胞中有选择性的表达,并且在不同的个体之间存在差异,从而为TSA依赖的免疫治疗提供了个性化的机会。

    一般来说,Ab靶点的选择大致分为三代:(a)第一代由“已验证抗原”组成,这些抗原已被广泛的实验和临床试验所证实;(b)第二代包括修饰肽,这意味着要么是与“验证抗原”不同的表位,要么是属性改进的相同表位;(c)第三代包括根据基因组学、蛋白质组学或基于细胞的功能策略筛选出的那些新发现的抗原。显然,TSAs的识别与第三代Ab靶点密切相关。从技术上讲,全外显子组测序与快速发展的软件算法相结合是目前识别新抗原最有趣和最有前途的方法。全外显子组测序是基因组相关技术中最重要的一种,包括获取DNA样本、将其拆分成碎片、筛选提取编码片段,扩增片段,测序片段,最后用参考基因组分析结果。根据DNA密码子配对原理,突变的DNA序列被转化为抗原中的氨基酸交替。随后,各种算法可用于预测对MHC分子具有高结合亲和力的新抗原。基于细胞的方法利用整个癌细胞作为平台,选择性地生成相应的单克隆抗体。筛选出与癌细胞表面抗原结合活性高的抗原。

    避免T细胞无能免疫治疗的组合策略

    在宿主免疫监视过程中,T细胞是抗原提呈细胞向T细胞受体(TCR)递呈MHC肽复合物、提供二级共刺激信号激活原始T细胞、促进效应T细胞增殖的重要前哨细胞。相反,如果共刺激分子缺失或被共抑制分子替代,即免疫检查点,T细胞功能失活或无能,从而无法特异性地清除肿瘤细胞。在众多免疫检查点中,程序性死亡受体1(PD-1,也称为CD279)是最重要的以及广泛研究的分子。它在TME的T细胞上表达,并与其配体PD-L1相互作用于肿瘤细胞或肿瘤浸润淋巴细胞,介导肿瘤免疫抑制。同时,已观察到bsAb依赖性治疗的临床疗效不足可能部分归因于TME中的免疫抑制,尤其是通过PD-1/PD-L1通路。例如,一项针对diabody格式的抗AC133×mCD3 bsAbs的研究报告了放疗诱导肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的凋亡以及随后肿瘤的生长,这是由PD-1途径介导的。因此,额外的PD-1阻断剂对增加TIL的数量非常有益,恢复抗肿瘤免疫效果,提高生存率。总的来说,组合策略主要包括免疫检查点阻断、CAR-T细胞和迄今为止的其他策略。

    策略1:同时应用BSAB和免疫检查点抑制单克隆抗体;免疫检查点抑制剂的应用促进了T细胞协同抗肿瘤免疫治疗的发展,特别是联合应用,招募和动员T细胞对抗癌症。在一项研究中,在小鼠模型中应用抗CD33×CD3的BiTE(AMG330)可导致肿瘤细胞PD-1上调,并显示出显著受损的T细胞介导的肿瘤细胞溶解。相反,阻断PD1/PD-L1相互作用增强了AMG330介导的细胞溶解。在另一项研究中,在anti-CEA×CD3的BiTE前双重给药抗PD-1和抗PD-L1单抗可有效地阻断TME中的免疫抑制,并使效应T细胞的细胞毒性最大化。在临床试验中,联合应用bsAb和免疫检查点抑制剂也可以协同作用,提高抗肿瘤效果和患者生存率。此外,在先前的抗药性HER2+乳腺癌治疗研究中,观察到使用HER2-TDB(一种基于曲妥珠单抗的T细胞招募bsAb)以及PD-L1抑制剂时的抗肿瘤效果。这些益处包括增强肿瘤生长抑制和增强反应持久性。最近,通过DNL方法构建新型三价T细胞重定向bsAb,即,(E1)-3s和(14)-3s,分别针对Trop-2和CEACAM5,与PD-L1阻断剂联合应用,在体外和体内均显示出增强的抗肿瘤活性。

    策略2:以免疫检查点为靶点的bsAb;这是同时利用免疫检查点阻断和bsAb技术的另一个有吸引力的选择,结果是设计同时针对免疫检查点和肿瘤抗原的bsAb,这在策略上优于免疫检查点抑制剂和bsAb的组合。从机制上讲,这是通过与TAA阳性癌细胞中的PD-1/PD-L1阻断剂结合来实现的。例如,一种抗PD-L1×EGFR bsAb来激活EGFR过表达肿瘤细胞中的PD-L1阻断剂。它具有对称的四价taFv-Fc形式的结构,具有一个Fc域来介导相关功能。已证实,抗PDL1×EGFR-bsAb可增强肿瘤部位的Ab积聚,同时预防多种上皮性恶性肿瘤(如结直肠癌和非小细胞肺癌)的严重系统性自身免疫相关不良事件。同样,一些研究人员设计了两种新的bsAb:抗PD-1×c-Met DVD-Ig和IgG单链抗体,这两种抗体在体外和体内均表现出有效的抗肿瘤免疫活性。同样,另一种靶向PD-L1和硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)的bsAb用于治疗黑色素瘤和其他CSPG4+恶性肿瘤时,在维持PD-1/PD-L1的安全性的同时,也有助于提高抗肿瘤的疗效和选择性。此外,使用抗CD33×CD3的BiTE作为支架,将PD-1的胞外区域融合到该支架上,以产生一种三特异性抗体,招募T细胞到CD33+AML细胞,并阻断PD-1的免疫检查点通路。

    虽然目前关于bsAb和免疫检查点阻断的联合研究大多集中在PD-1/PD-L1通路上,但其他免疫检查点,如细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4,CD152)和T细胞Ig粘蛋白3(TIM-3)也在免疫抑制性TME中发挥着不可或缺的作用。为进一步降低外周毒性而仅对肿瘤区域进行免疫检查点阻断,正在创造性地设计一组新的bsAb,以同时针对两个不同的免疫检查点,例如CrossMab格式的抗PD-1/TIM-3 bsAb,或靶向检查点抑制剂和T细胞共刺激受体,以IgG1形式的anti-CTLA-4×OX40bsAb(命名为ATOR 1015)。

    策略三:结合CAR-T细胞疗法提供共刺激信号;除上述T细胞免疫抑制信号外,在缺乏共刺激信号的情况下,通过CD28或4-1BB(CD137)分子持续刺激TCR-CD3信号通路是效应器T细胞无能或凋亡的另一个重要解释。最初,这个问题是通过使用抗4-1BB的单克隆抗体或4-1BBL的胞外域或抗CD28单抗作为佐剂辅助bsAb治疗来解决的,显示出效应T细胞激活时间的延长。此外,通过将肿瘤坏死因子超家族的两个成员(包括CD40L、CD27L、OX40L和4-1BBL)融合到一个T细胞重定位的diabody,最终增强T细胞刺激并提高抗肿瘤活性。然而,这些解决方案显示效应T细胞的持续时间相对较短。为了解决这一问题,一组研究人员提出了一种新型的T细胞靶向复合物来根除AML细胞,该复合物包括一个抗CD3×肽表位(E5B9)bsAb,即一个通用效应器模块和一个目标模块,该模块由一个与肽表位(E5B9)融合的抗CD33单链抗体和一个4-1BBL的胞外域组成。与传统的抗CD33×CD3的bsAb相比,该复合物不仅在激活T细胞和诱导CD33+肿瘤细胞溶解方面具有更高的疗效,而且通过额外的共刺激信号增强对CD33低表达细胞的杀伤作用。更重要的是,这种新颖、灵活的模块化系统可使抗肿瘤功能长期增强,在肿瘤中具有广泛的应用潜力。此外,为了提供长效效应T细胞功能,其他研究人员已经制定了一种优化策略,将bsAb策略与CAR-T细胞策略相结合,产生了一组新的bsAb。这种新的bsAb,命名为frBsAb,是由两个单抗的化学异共轭,融合叶酸受体(FR)和所选择的TAA。相应地,转化的T细胞被称为BsAb-IR28z,其细胞外FR结构域连接到CD8α-铰链和跨膜区;细胞内CD3z部分与CD28融合。因此,当frBsAbs将肿瘤细胞(通过对TAA的识别)交联到介导的T细胞时,它们不仅诱导短暂的T细胞活化,而且通过同时刺激共刺激分子CD28防止无能或抗原诱导的细胞死亡,最终发挥增强的抗肿瘤能力。在共刺激分子中,CAR-T细胞和bsAbs的结合也提供了许多优点,并且作为一种有前途的治疗恶性肿瘤的方法正在获得发展。最近,人们又设计了一种用于治疗多形性胶质母细胞瘤(GBM)的单一基因修饰T细胞产物CAR-T-EGFRvIII。BiTE-EGFR细胞分泌额外的抗EGFR×CD3,同时保持传统的CAR-T细胞骨架,并在T细胞表面表达EGFRvIII。由于EGFR和EGFRvIII都是GBM肿瘤细胞的关键靶点,这种创新性的发明比CAR-T细胞和bsAb作为单一疗法更具优势,因为它不仅证实了抗原阳性肿瘤亚型的有效抗肿瘤反应,而且对健康组织相对安全,而且还避免了其亲本技术的缺点,如肿瘤抗原异质性、全身应用相关非特异性毒性、持续注射的必要性、出现免疫抑制、T细胞衰竭等。

    本质上,到目前为止,一组创新的通用或模块化的CAR-(modCAR-)T细胞及其各自的适配器分子(CAR适配器)已经被用来规避传统CAR-T细胞的一些致命的副作用。该策略将TAA识别和T细胞激活分为两部分,并依赖于CAR适配器作为桥梁,将modCAR-T细胞重定位于多个TAA,并使用相同的modCAR-T细胞来靶向多种肿瘤类型,这样可以精细调节效应T细胞的功能而无需清除掉它们。目前,CAR适配器可根据其结构分为几个亚型,包括小分子(如叶酸和异硫氰酸荧光素)、单价和二价纳米体、单链抗体、Fabs和Abs。

    双特异性策略与NK细胞

    迄今为止,增强抗肿瘤免疫的大多数尝试都集中在通过CAR-T细胞或bsAb来增强T细胞的反应,特别是在blinatumomab成功后。然而,值得注意的是,这种T细胞靶向治疗受到一些毒副作用的限制,其中最具挑战性的是致命的细胞因子释放综合征(CRS)。尽管人们已经做出很大努力通过阻断IL-6或抑制单核细胞/巨噬细胞活化来逆转CRS,但在保持充分治疗潜力的同时实现最佳毒性管理仍然是一个挑战。此外,由于大多数T细胞重定位靶向bsAb旨在对抗血液恶性肿瘤,bsAb介导的关于实体瘤的治疗还需要进一步的研究。NK细胞作为天然免疫抗肿瘤的一线战士,在过去的几十年里也引起了广泛的关注。在人类中,各种研究表明NK细胞功能受损或缺失与肿瘤发生、发展和转移的高风险密切相关。值得注意的是,高比例的NK细胞浸润实体瘤与更好的临床疗效相关,这已在结直肠癌、乳腺癌、透明细胞肾癌、头颈癌和咽部癌中得到证实。因此,通过免疫治疗靶向NK细胞是一种很有吸引力的抗肿瘤策略。

    从机制上讲,活化的NK细胞可以通过三种直接或间接的策略清除肿瘤细胞:(a)释放颗粒,如分泌性溶酶体,其中含有穿孔素和颗粒酶,诱导细胞膜溶解或凋亡;(b)通过肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和Fas配体在肿瘤细胞上的相互作用来激活靶细胞caspase;(c)分泌多种因子调节其他免疫细胞功能,间接杀伤肿瘤细胞。基于这些理论,NK细胞接合器(NKCEs)和CAR-NK细胞被设计用来利用NK细胞介导的细胞毒性来对抗肿瘤。NKCE是通过连接抗NK细胞受体(主要是CD16)和一个TAA (bispecific killer engagers, BiKEs)或两个TAA(trispecific killer engagers, TriKEs)的单链抗体来构建的。到目前为止,抗CD16的BiTEs已经被有效地用于针对广泛的TAA,包括CD19、CD20、CD30、CD33、CD133和EPCAM。

    抗CD30×CD16A的BiKE(AFM13)的治疗复发或难治性CD30+霍奇金淋巴瘤或NHL的I/II期临床试验结果已发表。有趣的是,在一项骨髓增生异常综合征(MDS)的研究中,抗CD16×CD33的BiKE不仅能根除CD33+MDS细胞,而且还能靶向CD33+髓源性抑制细胞,以逆转TME中的免疫抑制,提高抗肿瘤的疗效。相比之下,使用额外的单链抗体,TriKEs通过靶向更多的taa或共同作用更多的NK细胞激活受体靶获得了更多的益处。最近,报道了一种显著的三功能NKCE,它与NK细胞上的CD16和NKp46(一种天然细胞毒性受体(NCR))以及肿瘤细胞上的TAA共同作用。在侵袭性和实体性B细胞淋巴瘤的小鼠模型中,这种设计巧妙的TriKE导致NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性充分激活和增强,并显示出比分别激活CD16和NKp46的BiKE更有效的抗肿瘤功能。此外,另外一个设计增加了IL-15交联剂,将抗CD16×CD33的BiKE升级为TriKE,由于NK细胞自我持续增殖,从而提高了肿瘤细胞杀伤效率。值得注意的是,抗CD16×IL-15×CD33的TriKE(GTB-3550)的单中心I/II期临床试验已经在进行中,用于治疗CD33+高危MDS,难治性/复发性AML,或晚期全身性肥大细胞增多症。除了优越的抗肿瘤作用外,BiKE和TriKE还比T细胞接合器具有更低的毒性和更高的安全性,这意味着CRS或非靶向细胞毒性的风险更低,在实体肿瘤中的应用前景更广阔。与NKCE类似,成熟的NK细胞也可以作为一个有趣的候选细胞来表达CARs,对抗丰富的TAA,如CD19、CD20、CD244和HER2。

    原位bsAb

    尽管bsAb取得了巨大的成功,但外源性给药的治疗潜力受到了短循环动力学和靶向非肿瘤毒性的阻碍。因此,研究人员提出了原位生成bsAb的概念,以克服免疫抑制性TME,避免持续的药物输注。目前,在肿瘤组织中制备bsAb的方法主要有工程溶瘤病毒(OVs)、转染T细胞和转染间充质干细胞(MSCs)。

    2015年,FDA批准了Imlygic,即转基因溶瘤HSV疗法 talimogene laherparepvec(T-VEC),并表达GM-CSF,用于治疗晚期黑色素瘤。这代表了OVs的一个里程碑,并促进了大量的临床前研究和临床试验。由于肿瘤特异性表达和病毒介导的T-cell募集的优势,OVs是一个诱人的bsAb输送平台。目前,这些携带BiTEs的OVs正在进行临床前评估:产生抗CD3×EphA2 BiTE的EphA2-T细胞疫苗病毒;抗EGFR×CD3 BiTE的腺病毒(ICOVIR-15K);抗CD3×CEA/CD20 BiTE的麻疹病毒(MV-BiTE);抗EpCAM×CD3 BiTE的工程化溶瘤B组腺病毒Enadenoutucirev(EnAd)。第一个携带BiTE的OV是一个双清除的痘苗病毒(western reverse Straine),其被设计为编码EphA2靶向BiTE,在A549肺癌异种移植模型中,加入外源性IL2可提高T细胞的体外活化和增殖,并提高存活率。后来,研究人员对腺病毒ICOVIR-15K进行了修饰,以产生抗EGFR×CD3的BiTE,成功地在不增加IL-2的情况下促进T细胞增殖。另一个类似的结构,MV-BiTE,为免疫功能正常的小鼠和实体瘤异种移植模型提供持续的免疫保护,并促进肿瘤的长期消退而不复发。携带抗EpCAM×CD3 BiTE的EnAd进一步显示了杀死靶细胞的能力,同时克服了人类原发恶性腹水样本中的免疫抑制性TME。总的来说,工程化产生BiTE的OVs可以通过非特异性的直接溶瘤或感染抗原阳性的癌细胞来攻击和杀死癌细胞,然后是BiTE的复制依赖性表达,激活内源性CD4+和CD8+T细胞,从而对这些癌细胞产生免疫介导的细胞毒性。这种改进的溶瘤病毒疗法由于其优于传统的OVs或bsAb而具有光明的前景:(a)来自修饰OVs的biTEs选择性地靶向抗原阳性的癌细胞,而不依赖于MHC/TCR分子呈现或其他共刺激信号,因此,即使在癌细胞失去MHC表达的情况下,也能提高抗肿瘤T细胞反应的效力并激发免疫。(b) 在晚期病毒启动子的控制下,通过限制病毒感染癌细胞的持续BiTE产生,不仅使系统毒性最小化,而且使BiTE在TME中的浓度大大提高,同时也解决了BiTE的半衰期短的问题。(c) OVs主要在癌细胞中感染和复制,并在细胞间传播,减轻了邻近健康组织的损伤。(d)BiTE既可以针对病毒感染的癌细胞,也可以针对未感染抗原阳性的癌细胞。(e) 改良OVs可刺激CD4+和CD8+T细胞介导免疫,同时规避免疫抑制。(f) 该方法安全性高,毒副作用小,应用方便。此外,与靶向肿瘤抗原的改良OVs类似,携带BiTEs靶向间质细胞抗原的OVs对难治性、富间质性肿瘤有较好的疗效。编码以成纤维细胞活化蛋白(FAP)为靶点的基因工程酶,不仅可以杀死感染和复制的肿瘤细胞,而且还可以利用随后产生的抗FAP的BiTE激活T细胞,选择性地耗尽FAP+癌相关成纤维细胞(CAFs)。它们最终逆转CAF介导的免疫抑制,打破间质屏障,使OVs渗透到肿瘤部位,并协同使TME恢复到免疫反应状态。

    转染自体肿瘤特异性T细胞;目前,转染的自体肿瘤特异性T细胞由于实现了CAR-T细胞与bsAb的理论结合,并克服了两者的局限性而备受关注。近十年前,当人类外周血淋巴细胞,尤其是CD3+T细胞,被工程化的基于HIV-1的慢病毒载体转染,在体内产生抗CEA×CD3 diabody的细胞时,淋巴细胞首次被认为是bsAb的载体。最近,CD123-ENG T细胞可以证明这一点,它是由一种编码双特异性接合器分子的逆转录病毒载体转导的,该分子靶向AML和CD3+T细胞的CD123+肿瘤细胞。从机制上讲,ENG T细胞不仅识别和杀死CD123+肿瘤细胞,而且通过抗原依赖性的BiTE分泌,将未修饰的旁观者T细胞重定向并激活到肿瘤部位,协同产生强大的抗肿瘤免疫反应。此外,为了避免对正常造血干细胞和祖细胞的意外和过度杀伤,CD20.CD123-ENG T细胞被设计为包含自杀基因CD20,它允许在利妥昔单抗和补体存在下选择性耗竭。其他类似的ENG T细胞包括EphA2-ENG T细胞和CD19-ENG T细胞。此外,一些研究人员通过mRNA电穿孔技术和快速T细胞扩增方案构建了CD19-BiTE转移的T细胞,在体外和侵袭性Nalm6白血病小鼠模型中,与CAR RNA转染的T细胞相比,其抗肿瘤免疫能力也得到增强。转基因T细胞显示出明显的优越性,因为一旦被激活,就会产生增强的BiTE,将驻留的T细胞重新定向到肿瘤部位。为了进一步提高抗肿瘤效率,将共刺激分子CD28和/或4-1BBL引入ENG T细胞表面,即CD19-ENG.4-1BBL/CD80,显著增加抗原依赖性细胞因子(IL-2和IFNγ)的产生,并促进T细胞的增殖,最终在体内外表现出最佳反应。

    转染间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)除了肿瘤细胞和T细胞外,MSC也可以作为一种细胞载体,实现bsAb的原位稳定表达。骨髓间充质干细胞具有免疫原性低、向肿瘤部位迁移的趋势、追踪显微转移的能力以及易于通过病毒载体进行转导的独特优势。在一项研究中,通过慢病毒载体对永生化人源性MSC系(SCP-1)进行了基因修饰,以产生完全人源化的抗CD33×CD3 bsAb提高共刺激分子4-1BBL的表达。增强的抗抗原特异性T细胞反应使MSCs成为bsAb靶向肿瘤的有效传递者,从而延长肿瘤消退时间。另一项研究使用转染的人脐带来源的MSCs分泌抗CD19×CD3 TandAbs,同时使用吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)途径抑制剂,D-1MT,证明这种组合是一种很有前途的治疗策略。此外,E1A修饰的MSCs也可以被设计成病毒转运体和放大器,释放工程腺病毒并在到达肿瘤部位或转移灶后重新感染肿瘤细胞,它们分泌bsAb并激活T细胞对肿瘤的反应。这是一个双重病毒装载MSC(命名为MSC.CD3-HAC.E1A)携带双功能融合蛋白CD3-HAC,由抗CD3单链抗体和高亲和力共识(HAC)PD-1组成,最终促进肿瘤的消除和逆转TME的免疫耐受。

    Minicircle(MC);MC是体内生产bsAb的另一种有前途的替代品。它是一组非病毒性的DNA载体,通过流体动力学过程将转基因产物输送到小鼠肝脏后,能够持续高水平地表达转基因产物。一些研究人员利用MC设计了MC-bsAb,生成了抗CD20×CD3-bsAb,在体外和异种移植小鼠模型中介导T细胞杀伤人类B细胞淋巴瘤细胞。这种方法非常有吸引力,因为它相对稳定,价格低廉,并且能够在数周甚至更长时间内维持血液循环中的bsAb的治疗浓度。

    展望

    在过去的30年里,人们目睹了一个巨大的转变,从仅仅开发和改造基本的Abs,发展到更复杂的Ab衍生物,其形状和尺寸多种多样,尤其是bsAb。bsAb技术在临床应用中具有非凡的前景,吸引了研究人员的注意并已发展出极为丰富的形式,为基于BSAB的癌症免疫治疗奠定了坚实的基础。截至2019年9月20日,NCBI的官方网站上共发布了183项bsAb的临床试验(大多数在癌症领域)。然而,尽管有上述各种各样的策略,商业化生产bsAb药物的过程仍然受到各种障碍的阻碍。更具体地说,bsAb的制造既耗时又昂贵。它需要合适、安全、经济的细胞系生产、程序、分析和纯化方法来获得所需的产品。此外,Ab生产后的一系列问题,包括但不限于Abs的降解、聚集、变性、破碎和氧化,必须在给到患者之前解决。同时,还需要更多的临床试验来探索最佳给药途径和最佳剂量,以提高靶组织的浓度,减少全身副作用,甚至是控释制剂。

    总体而言,据估计,目前临床试验中的大多数bsAb(67%)旨在对抗血液恶性肿瘤。相比之下,靶向实体肿瘤的bsAb值得进一步研究,因为其对正常组织或其他复杂因素(包括免疫耐受性癌间质、新生血管紊乱,bsAb药物的渗透不足)有不可避免的不良影响。因此,人们对正在进行的实体肿瘤中的bsAb研究充满热情,这些研究有望在不久的将来产生有希望的结果,尽管将bsAbs转化为临床适用的药物可能耗时且需要大量的努力。总之,bsAb研究的结果证明了这些分子在新的药物设计和随后的癌症治疗临床应用中的前景。

    参考文献:

    Challenges and strategies for next-generation bispecific antibody-based antitumor therapeutics. Cell Mol Immunol. 2020 May;17(5):451-461.

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